CannaData

Hlavní sloučeninou zodpovědnou za intoxikační aktivitu rostliny konopí Cannabis sativa L je (-)-Trans-Δ9-tetrahydrokanabinol (Δ9-THC). Biologickou aktivitu tohoto kanabinoidu ovlivňuje délka postranního alkylového řetězce. Především syntetické analogy Δ9-THC s delším postranním řetězcem vykazovaly mnohem vyšší kanabimimetické vlastnosti než Δ9-THC přírodního původu. Při snaze definovat fytokanabinoidní profil, který charakterizuje odrůdy léčivého konopí, byl objeven nový fytokanabinoid se stejnou strukturou jako Δ9-THC, ale s seven-term alkylovým postranním řetězcem.

Nazývá se (-)-Trans-Δ9-tetrahydrocannabiphorol (Δ9-THCP). Podle názoru italských vědců by mohl zodpovídat za farmakologické vlastnosti některých odrůd konopí, u kterých je obtížné je vysvětlit přítomností samotného Δ9-THC.

Úvod do studie    

Konopí, Cannabis sativa, bylo vždy považováno za kontroverzní rostlinu. Kromě prokázaných prospěšných účinků na některé nemoci (včetně glaukomu a epilepsie aj.) je konopí známo jako neocenitelný zdroj živin (ze semínek), surovina šetrná k životnímu prostředí, materiál pro výrobu textilu. Současně je nejrozšířenější nedovolenou drogou na světě.

Zvláštností této rostliny je schopnost produkovat třídu organických molekul nazývaných fytokanabinoidy, které jsou odvozeny od enzymatických reakcí mezi resorcinolem a isoprenoidovou skupinou. Modularita těchto dvou součástí je klíčem pro extrémní variabilitu výsledného produktu, která vedla k objevu téměř 150 odlišných (dosud známých) kanabinoidů. Kyselina olivetolová a geranyl pyrofosfát, které se účastní kondenzační reakce vedoucí k tvorbě kyseliny kanabigerolové (CBGA), jsou prekurzory nejčastěji se vyskytujících fytokanabinoidů.

Působením specifického enzymu cyklázy se může CBGA přetvořit na kyselinu tetrahydrokanabinolovou (THCA), kanabidiolovou (CBDA) nebo kanabichromenovou (CBCA). Všechny fytokanabinoidy jsou biosyntetizovány v karboxylové formě, která může být přeměněna pomocí tepla na odpovídající dekarboxylovanou (nebo neutrální) formu. Nejznámějšími neutrálními kanabinoidy jsou bezpochyby Δ9-tetrahydrokanabinol (Δ9-THC) a kanabidiol (CBD), přičemž první je zodpovědný za opojné vlastnosti konopí a druhý působí protizánětlivě, antikonvulzivně nebo jako antioxidant. Současně také jako antagonista negativních THC účinků.

Všechny tyto kanabinoidy jsou charakterizovány přítomností alkylového postranního řetězce na resorcinylové části tvořené pěti atomy uhlíku. Avšak jsou známy i další fytokanabinoidy s odlišným počtem atomů uhlíku na postranním řetězci a nazývají se varinoidy (s třemi atomy uhlíku), jako je kanabidivarin (CBDV) a Δ9-tetrahydrokanabivarin (Δ9-THCV), a orcinoidy (s jedním atomem uhlíku), jako je kanabidiorkol (CBD-C1) a tetrahydrokanabiorcol (THC-C1). Podle dřívějšího výzkumu, jsou obě řady v rostlině biosyntetizovány jako specifické ketidové syntázy.

Italská výzkumná skupina už dříve oznámila přítomnost butylových kanabinoidních řad s four-term alkylovým řetězcem, zejména kanabidibutol (CBDB) a Δ9-tetrahydrokanabutol (Δ9-THCB), v CBD vzorcích získaných z technických i léčebných odrůd konopí. Protože nebyl předložen dosud žádný důkaz přítomnosti rostlinných enzymů zodpovědných za biosyntézu těchto butylových fytokanabinoidů, navrhlo se, že by mohly být odvozeny od mikrobiální ω-oxidace a dekarboxylace jejich odpovídajících five-term homologů.

Délka alkylového postranního řetězce se skutečně ukázala klíčovým parametrem, farmakokorem, pro biologickou aktivitu vyvíjenou Δ9-THC na lidském kanabinoidním receptoru CB1, což dokládají studie vztahu mezi strukturou a aktivitou shromážděné v dřívějších článcích. Pro vazbu na receptor jsou nutné minimálně tři atomy uhlíku. Dále pak s osmi-uhlíkovým postranním řetězcem byla zaregistrována nejvyšší aktivita, která se snížila s vyšším počtem atomů uhlíku. Homology Δ8-THC s více než pěti atomy uhlíku na postranním řetězci byly vyrobeny synteticky a testovány za účelem, aby měly molekuly několikrát potentnější než Δ9-THC.

Podle italských vědců nebyl dosud popsán žádný přirozeně se vyskytující fytokanabinoid s lineárním alkylovým postranním řetězcem obsahujícím více jak pět atomů uhlíku.

Výzkumná skupina však poprvé odhalila přítomnost seven-term homologu CBD a Δ9-THC v léčebné odrůdě Italian FM2, kterou poskytl Vojensko-chemický farmaceutický institut ve Florencii (Military Chemical Pharmaceutical Institute - MCPI). Vědcům se podařilo izolovat a plně charakterizovat dva nové fytokanabinoidy, jejichž absolutní konfigurace byla potvrzena pomocí stereoselektivní syntézy.

Podle International Non-proprietary Name (INN) byly těmto analogům navrženy názvy “cannabidiphorol“ (CBDP) a „tetrahydrokanabiphorol“ (THCP). Přípona “-phorol“ pochází z výrazu “sphaerophorol“, běžného názvu pro 5-heptyl-benzen-1,3-diol, který tvoří resorcinylovou skupinu těchto dvou nových fytokanabinoidů.

Díky dříve uveřejněným studiím očekávala vědecká skupina, že THCP má ještě vyšší vazebnou afinitu k receptoru CB1 a větší kanabimimetickou aktivitu než samotné THC. Vazebná afinita THCP k receptoru CB1 byla testována pomocí radioligandového testu v in vitro podmínkách a jeho kanabimimetická aktivita byla hodnocena pomocí tetrádových behaviorálních testů na myších.

Výsledky

Identifikace kanabidiforolu (CBDP) a Δ9-tetrahydrokanabiforolu (Δ9-THCP) pomocí kapalinové chromatografie spojenou s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (LC-HRMS)

Etanolový extrakt FM2 byl analyzován pomocí nedávno vyvinuté analytické metody pro profilování kanabinoidů této odrůdy léčebného konopí. Protože nativní extrakt obsahuje hlavně karboxylované formy fytokanabinoidů jako důsledek extrakce za studena, část rostlinného materiálu byla zahřáta kvůli dosažení dekarboxylace, protože tam jsou převládajícími formami neutrální fytokanabinoidy. K analýze extraktů z FM2 a k výzkumu fragmentačního spektra analytů byla použita pokročilá analytická platforma vysoce účinné kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií Orbitrap s vysokým rozlišením.

Extrahované iontové chromatogramy (EIC) CBDP a Δ9-THCP ze standardní, nativní a dekarboxylované směsi při 25 a 10 ng/ml a srovnání fragmentačních spekter syntetického a přírodního CBDP a Δ9-THCP s vysokým rozlišením v pozitivním (ESI+) a negativním (ESI-) módu. Viz Obrázek 1.

(1a) Prekurzorové ionty neutrálních derivátů CBDP a Δ9-THCP (341.2486 pro [M-H]− a 343.2632 pro [M + H]+) vykazovaly eluční čas 19,4 minut pro CBDP a 21,3 minut pro Δ9-THCP.

(1b) Jak bude popsáno později, jejich identifikace byla potvrzena vstříknutím směsi (5 ng/ml) dvou chemicky syntetizovaných CBDP a Δ9-THCP. Pokud jde o jejich karboxylovaný protějšek, prekurzorové ionty neutrálních forem CBDP a Δ9-THCP se v režimu (ESI+) rozpadají stejně, ale v (ESI-) režimu vykazují odlišný fragmentační vzorec.

Zatímco Δ9-THCP ukazuje pouze prekurzorový ion [MH] (1d), molekula CBDP generuje fragmenty v m/z 273,1888 odpovídající retro Diels-Alderově reakci a 207,1381 odpovídající rezorcinylové skupině po přerušení vazby s terpenoidní skupinou (1c).

Je pozoruhodné, že pro obě molekuly, CBDP a Δ9-THCP, se každý fragment v obou ionizačních režimech přesně liší etylenovou jednotkou (CH2) od odpovídajících five-termed homologů CBD a THC.

Kromě toho delší čas eluce potvrzuje hypotézu seven-termed fytokanabinoidů s ohledem vyšší lipofilitě posledně jmenovaného.

Izolace a charakterizace přírodního CBDP a Δ9-THCP

Aby bylo možné selektivně získat na kanabinoidy bohatou frakci FM2, použil se k extrakci suroviny n-hexan místo ethanolu, protože ten přenáší spolu s kanabinoidy ještě další kontaminanty jako jsou flavonoidy a chlorofyly.

K získání čistého kanabinoidního extraktu byl nutný další krok, zbavení vosku při -20° C po 48 hodin a odstranění vysráženého vosku. Polopřípravná kapalná chromatografie se stacionární fází C18 umožnila separaci 80 frakcí, které byly analyzovány dříve popsanou metodou pomocí LC-HRMS. Tímto způsobem byly frakce obsahující převážně kyselinu kanabidiforolovou (CBDPA) a tetrahydrokanabiforolovou (THCPA) samostatně podrobeny zahřívání na 120° C po dobu 2 hodin, aby se získaly jejich odpovídající neutrální protějšky CBDP a Δ9-THCP ve formě čirých olejů s větší než 95% čistotou. Takto získaný materiál postačoval pro úplnou charakterizaci pomocí 1H a 13C nukleární magnetické rezonance (NMR), cirkulárního dichroismu (CD) a UV absorpce

Stereoselektivní syntéza CBDP a Δ9-THCP

• (-)-trans-Cannabidiphorol ((-)-trans-CBDP) a (-)-trans-Δ9-tetrahydrocannabiphorol ((-)-trans-Δ9-THCP) byly stereoselektivně syntetizovány, jak bylo dříve hlášeno pro syntézu homologů (-)-trans-CBDB a (-)-trans-Δ9-THCB.
• V souladu s tím byl (-)-trans-CBDP připraven kondenzací 5-heptylbenzen-1,3-diolu s (1S, 4R) -1-methyl-4-(prop-1-en-2-yl)cykloex-2-enolem a použitím pTSA jako katalyzátoru po dobu 90 minut.
• Delší reakční doba nevylepšila výtěžek (-)-trans-CBDP protože došlo k cyklizaci (-)-trans-CBDP na (-)-trans-Δ9-THCP a pak na (-)-trans-Δ8-THCP.
• Jak ukazuje Příloha SI-1, 5-heptylbenzen-1,3-diol byl syntetizován jako první.
• Konverze (-)-trans-CBDP na (-)-trans-Δ9-THCP s využitím různých Lewisových kyselin, jak bylo už uvedeno v dřívějších studiích pro syntézu homologu Δ9-THC, vedla ke komplexní směsi izomerů, což s využitím standardních chromatografických technik vyústilo v pracnou izolaci (-)-trans-Δ9-THCP s nízkým výtěžkem.
• Proto pro syntézu (-)-trans-Δ9-THCP byl nejprve syntetizován jeho regioizomer (-)-trans-Δ8-THCP kondenzací 5-heptylbenzen-1,3-diolu s (1S, 4R) -1-methyl-4-(prop-1-en-2-yl) cykloex-2-enolem, jak je popsáno výše, ale reakce probíhala 48 hodin.

Alternativně lze (-) -trans-CBDP také kvantitativně převést na (-)-trans-Δ8-THCP ve stejných podmínkách. Hydrochlorace Δ8 dvojné vazby (-)-trans-Δ8-THCP pomocí ZnCl2 jako katalyzátoru umožnila získat (-)-trans-HCl-THCP, který byl úspěšně převeden na (-)-trans-Δ9-THCP s 87% výtěžkem pomocí selektivní eliminace na pozici 2 terpenové skupiny při použití t-amylátu draselného jako báze. Viz Obrázek 2a.

Chemická identifikace syntetických (-)-trans-CBDP a (-)-trans-Δ9-THCP a jejich jednoznačné přiřazení 1H a 13C bylo dosaženo pomocí NMR spektroskopie. Viz Příloha SI-1,2 a SI-2,3.

Protože (-)-trans-CBDP a (-)-trans-Δ9-THCP se liší od příslušných homologů (CBD, CBDB, CBDV, Δ9-THC, Δ9-THCB a Δ9-THCV) pouze délkou alkylového řetězce na resorcinylové skupině, u homologů CBD a Δ9-THC nebyly pozorovány významné rozdíly v chemických posunech protonů terpenů a aromatických skupin.

Dokonalá shoda v chemickém posunu terpenových a aromatických skupin mezi syntetizovanými (-)-trans-CBDP a (-)-trans-Δ9-THCP a příslušnými homology, v kombinaci s hmotnostním spektrem a fragmentačním vzorcem umožnilo jednoznačně potvrdit chemickou strukturu dvou nových syntetických kanabinoidů. Trans konfigurace (1R,6R) terpenové skupiny byla potvrzena optickou rotační silou.

Nové kanabinoidy (-)-trans-CBDP a (-)-trans-Δ9-THCP vykázaly v chloroformu [α]D20 −145° a −166°. [α]D20 hodnoty byly v souladu s hodnotami homologů, což naznačuje (1R,6R) konfiguraci pro CBDP a Δ9-THCP.

Pozorována byla také perfektní superimpozice mezi 1H (viz Obrázek 2b,e) a 13C NMR spektra (viz Obrázek 2c,f) a absorpcí cirkulárního dichroismu (viz Obrázek 2d,g) syntetického i extrahovaného (-)-trans-CBDP a (-)-trans-Δ9-THCP, což potvrzuje identitu dvou nových kanabinoidů identifikovaných v odrůdě konopí FM2.

Vazebná afinita na lidské receptory CB1 a CB2

Vazebná afinita (-)-trans-Δ9-THCP proti purifikovaným lidským CB1 a CB2 receptorům byla stanovena pomocí vazebného testu radioligandů při použití referenčních sloučenin [3H]CP55940 nebo [3H]WIN 55212-2 a při stanovení křivek závislosti reakce na dávce.

• (-)-trans-Δ9-THCP se s vysokou afinitou váže na oba lidské CB1 a CB2 receptory s Ki = 1.2 a 6.2 nM.
• (-)-trans-Δ9-THCP byl proti receptoru CB1 ve výsledku 33 krát aktivnější než (-)-trans-Δ9-THC (Ki = 40 nM), 63 krát aktivnější než (-)-trans-Δ9-THCV (Ki = 75,4 nM) a 13 krát aktivnější než nově objevený (-)-trans-Δ9-THCB (Ki= 15 nM).
• Kromě toho, nově identifikovaný (-)-trans-Δ9-THCP byl proti receptoru CB2 ve výsledku přibližně 5 až 10 krát aktivnější (Ki = 6,2 nM) než (-)-trans-Δ9-THC, (-)-trans-Δ9-THCB a (-)-trans-Δ9-THCV, které místo toho vykazovaly srovnatelnou vazebnou afinitu s Ki hodnocením v rozmezí 36 až 63 nM. Viz Obrázek 3a.

• a) Vazebná afinita (Ki) čtyř homologů Δ9-THC proti CB1 a CB2 receptorům.
• b) Studie odpovědi v závislosti na dávce Δ9-THC proti lidskému CB1 (modrá barva) a CB2 (šedá) receptoru. Všechny pokusy proběhly duplikovaně a chybové sloupce označují SEm při měření.
• c) Dokovací pozice (-)-trans-Δ9-THCP (modré tyčinky) v komplexu s lidským CB1 receptorem (PDB ID: 5XRA, oranžová kresba). Klíčové aminokyselinové zbytky znázorňují oranžové tyčinky. H-vazby znázorňují žluté tečkované čáry. Heteroatomy jsou barevně označeny: kyslík červeně, dusík modře, síra žlutě.
• d) Vazebná kapsa lidského receptoru CB1 zvýrazňující pozici heptylového řetězce v dlouhém hydrofobické kanálu receptoru (žlutá přerušovaná čára). Postranní hydrofobická kapsa je ohraničena fialovou barvou. Část c a d byla vytvořena pomocí Maestro 10.3 Schrödinger Suite.

Nejvyšší aktivita (-)-trans-Δ9-THCP byla v porovnání s kratšími homology odhalena pomocí dokovací kalkulace. Rentgenová struktura aktivní konformace lidského CB1 receptoru v komplexu s agonistou AM11542 (PDB ID: 5XRA) byla použita jako reference pro dokování, protože označené strukturální změny v orthosterické ligandní vazbě jsou pozorovatelné při srovnání s konformací receptoru vázánou na antagonistu. AM11542 je syntetický Δ8 kanabinoid s vysokou afinitou vůči lidskému CB1 receptoru (Ki = 0,11 nM) ovládající 7′-bromo-1′,1′-dimethyl-heptyl alifatický řetězec na C3 resorcinylové skupině.

Jak se očekávalo vzhledem k těsné chemické podobnosti, předpokládaný režim vazby (-)-trans-Δ9-THCP (viz Obrázek 3c) odrážel režim AM11542 v krystalové struktuře CB1 (viz Příloha SI-6a,b). (-)-trans-Δ9-THCP je vázaný v aktivní konformaci CB1 ve tvaru písmene L. Kruhový systém tetrahydro-6H-benzo[c]chromenu je umístěn v hlavní hydrofobické kapse vymezené Phe174, Phe177, Phe189, Lys193, Pro269, Phe170, a Phe268.

Aromatický kruh resorcinylové skupiny se podílí zejména na dvou edge-to-face π-π interakcích s Phe170 a Phe268, zatímco fenolická hydroxylová skupina na C1 je zapojena do H-vazby s Ser383 (viz Obrázek 3c). Je zajímavé, že heptylový řetězec na C3 se rozšířil do dlouhého hydrofobického tunelu tvořeného Leu193, Val196, Tyr275, Iso271, Leu276, Trp279, Leu359, Phe379, a Met363 (Viz Obrázek 3c, d).

Protože předpovídané postavení tricyklického tetrahydrokanabinolového kruhového systému je mezi čtyřmi THC homology zachováno (viz Příloha SI-7a-c), délka alkylového řetězce na C3 resorcinylové skupiny by mohla odpovídat za různé vazební afinity pozorované mezi čtyřmi kanabinoidy. (-)-trans-Δ9-THCP (viz Obrázek 3c) a (-)-trans-Δ9-THC (viz Příloha SI-7a) sdílejí stejné umístění alkylového „ocasu“ v hydrofobním kanálu.

Dlouhý heptylový řetězec Δ9-THCP je však schopen zasahovat do tunelu po celé své délce, čímž maximalizuje hydrofobickou interakci s rezidui postranního kanálu. Naproti tomu, tunel je obsazen kratším pentylovým řetězcem (-)-trans-Δ9-THC pouze částečně, což odpovídá vyšší afinitě Δ9-THCP (Ki = 1,2 nM) v porovnání s Δ9-THC (Ki = 40 nM). Místo kratších homologů alkylového řetězce, Δ9-THCV a Δ9-THCB, bylo předpovězené jiné umístění „ocasu“. Propylový a butylový řetězec Δ9-THCV a Δ9-THCB jsou příliš krátké na to, aby účinně dosahovaly v rámci hydrofobního kanálu.

Jak bylo uvedeno v dřívější studii, tyto kratší řetězce se přizpůsobí malé hydrofobní kapse vymezené Phe200, Leu359, and Met363 (viz Příloha SI-7b,c). Tato postranní kapsa je umístěna při vložení mezi hlavní hydrofobní kapsu a dlouhý kanál (viz Obrázek 3d) a zdá se, že se přizpůsobí malým hydrofobickým substituentům (tj. gem-dimetyl nebo cykloalkyl) zavedeným na C1 pozici postranního řetězce několika syntetických kanabinoidů, racionalizujícím významné zvýšení v potenci a afinitě pro tyto deriváty.

Stanovení kanabinoidního profilu Δ9-THCP in vivo

Kanabinoidní aktivita Δ9-THCP byla vyhodnocena čtveřicí behaviorálních testů na myších. To zahrnovalo hodnocení spontánní aktivity, index imobility (katalepsie), analgezii a změny rektální teploty. Snížení pohybové aktivity, katalepsie, analgezie a hypotermie jsou dobře známé příznaky fyziologických projevů kanabinoidní aktivity.

Po intraperitoneálním (i.p.) podání Δ9-THCP při 2,5 mg/kg snížilo výrazně spontánní aktivitu myší v Open field testu, zatímco při 5 a 10 mg/kg vyvolalo katalepsii na kruhu s imobilitou, jak bylo zjištěno srovnáním se skupinou ošetřenou vehikulem (viz Obrázek 4b,c). (0 mg/kg: 6888 cm ± 474.8, 10 mg/kg: 166.8 cm ± 20.50, 5 mg/kg: 127.5 cm ± 31.32, 2.5 mg/kg: 4072 cm ± 350.8, p = 0.0009).

Navíc podávání Δ9-THCP vyvolalo při dávkách 5 a 10 mg/kg významný nárůst latence pro přesun z katalepsie (viz Obrázek 4e). (0 mg/kg: 15.20 s ± 4.33, 10 mg/kg: 484.5 s ± 51.58, 5 mg/kg: 493.4 s ± 35.68, 2.5 mg/kg: 346.1 s ± 35.24, p = 0.0051).

Při hot plate testu (viz Obrázek 4f) vyvolala dávka Δ9-THCP (10 a 5 mg/kg) antinociceptivní účinek, zatímco při 2,5 mg/kg byl zaznamenán trend v indukci antinocicepse, který ale nebyl statisticky významný.

(0 mg/kg: 19.20 s ± 2.65, 10 mg/kg: 57.0 s ± 2.0, 5 mg/kg: 54.38 s ± 2.86, 2.5 mg/kg: 40.22 s ± 5.8, p = 0.0044).

Podání Δ9-THCP vyvolalo v závislosti na dávce významné snížení tělesné teploty (pouze při 10 mg/kg) ve srovnání s vehikulem. (0 mg/kg: 0.40 °C ± 0.25, 10 mg/kg: −7.10 °C ± 0.43, 5 mg/kg: −5.28 °C ± 0.36, 2.5 mg/kg: −4,12 °C ± 0.38, p = 0.0009). Viz Obrázek 4d.

• (a) Časový plán tetrády testů v minutách od podání Δ9-THCP nebo vehikula
• (b, c) Snížení lokomoce vyvolané podání Δ9-THCP v Open field testu
• (d) Snížení tělesné teploty po podání Δ9-THCP; hodnoty jsou vyjádřené jako rozdíl mezi bazální teplotou (tj. před podáním Δ9-THCP nebo vehikula) a teplotou změřenou po podání Δ9-THCP nebo vehikula.
• (e) zvýšení latence pro přesun z katalepsie po podání Δ9-THCP
• (f) zvýšení latence po prvních příznacích bolesti, které se u myší projevily v Hot plate testu po podání Δ9-THCP.

Data jsou uvedena jako průměr ± SEM u pěti myší na skupinu.

Semikvantifikace CBDP a Δ9-THCP v FM2 extraktu

Semi-kvantifikační metoda založená na LC-HRMS umožnila poskytnout přibližné množství dvou nových fytokanabinoidů v etanolovém roztoku FM2. Jejich pentylové homology, CBD a Δ9-THC, vykazovaly koncentraci 56 a 39 mg/g, v souladu s hodnotami stanovenými MCPI (59 mg/g pro CBD, 42 mg/g pro Δ9-THC), které byly získané kvantitativní metodou GC-FID. Stejná semi-kvantitativní metoda poskytla množství okolo 243 µg/g pro CBDP a 29 µg/g Δ9-THCP.

Diskuse

Ačkoliv bylo dosud detekováno v rostlině konopí téměř 150 fytokanabinoidů, většina z nich nebyla izolována nebo charakterizována. Rozsáhlý výzkum známých CBD a Δ9-THC prokázal, že mají zajímavé farmakologické profily, takže, jak dokládá rostoucí počet publikací, vzrostla i pozornost věnovaná biologické aktivitě jejich známých homologů (CBDV a Δ9-THCV).

Jiné homology, jako jsou ty, které patří do skupiny orcinoidů, jsou zkoumány minimálně. Pravděpodobně je to kvůli jejich velmi malému množství v rostlině, což ztěžuje jejich izolaci. V posledních letech dosáhl zemědělský genetický výzkum značného pokroku při selekci vzácných kmenů, které produkují vysoké množství CBDV, CBG a Δ9-THCV. Proto by v blízké budoucnosti nebylo překvapivé, že se objeví odrůdy konopí bohaté na ostatní minoritní fytokanabinoidy.

Genetická selekce by umožnila produkci extraktů bohatých na specifické fytokanabinoidy s charakteristickým farmakologickým profilem. Z tohoto důvodu je důležité provést komplexní chemické profilování léčebných odrůd konopí a věnovat se důkladnému zkoumání farmakologické aktivity minoritních a méně známých fytokanabinoidů.

Protože farmakologická aktivita Δ9-THC je připisována obzvláště jeho afinitě k CB1 receptoru, literatura naznačuje, že ta může být zvýšena prodloužením alkylového postranního řetězce, který představuje hlavní kanabinoidní farmakologickou hnací sílu. Proto, když byl THC považován za hlavní sloučeninu, byla řada kanabinoidů chemicky syntetizována a jejich biologická potence byla ve výsledku několikrát vyšší než Δ9-THC samotný. Podle nejlepších znalostí autorů však nebyly v rostlinách konopí nikdy detekovány nebo identifikovány přirozeně se vyskytující kanabinoidy s lineárním alkylovým řetězcem delším než five-terms.

Špičková technologická platforma hmotnostní spektrometrie Orbitrap a použití pokročilých analytických metod, jako je metabolomika, však mohou s vysokým stupněm důvěry umožnit objevení a identifikaci nových sloučenin, i když jsou přítomny ve stopách složitých matric. V této práci je uvedena poprvé izolace a plná charakterizace dvou nových heptylových homologů CBD a Δ9-THC, které byly pojmenovány cannabidiphorol (CBDP) a Δ9-tetrahydrocannabiphorol (Δ9-THCP). Obecná jména byla odvozena od tradičního pojmenování fytokanabinoidů založených na resorcinylových reziduích, v tomto případě odpovídajícím sphaerophorolu.

Biologické výsledky získané pomocí vazebního testu v in vitro podmínkách naznačovaly afinitu k receptoru CB1 více než třicet krát vyšší než je v literatuře uváděná afinita Δ9-THC. Tato data byla podpořena v in vivo podmínkách pomocí tetrádového testu kanabimimetické aktivity, kde Δ9-THCP snížil lokometrickou aktivitu a rektální teplotu, vyvolal katalepsii a vytvořil analgesii napodobující vlastnosti úplných CB1 agonistů. (Viz Obrázek 4).

Ukázalo se především, že Δ9-THCP je stejně aktivní jako Δ9-THC, ale při nižších dávkách. Ve skutečnosti je minimální dávka THC používaná při tomto druhu testů 10 mg/kg, zatímco Δ9-THCP byl aktivní při 5 mg/kg u tří ze čtyř provedených testů. Tyto výsledky doprovázené docking daty, jsou v souladu s rozsáhlými SAR studiemi vztahů mezi strukturou a aktivitou prováděnými v průběhu let na syntetických kanabinoidech. Tyto studie odhalují důležitost délky alkylového řetězce na pozici 3 resorcinylové skupiny při modulování ligandní afinity na CB1 receptoru.

Ačkoliv by se množství heptylových homologů CBD a Δ9-THC v odrůdě FM2 mohlo zdát nepatrné, v in vitro i in vivo studiích uvedených v tomto textu ukázal Δ9-THCP několikrát vyšší kanabimimetickou aktivitu než jeho pentylový homolog Δ9-THC. Navíc je rozumné předpokládat, že jiné odrůdy konopí mohou obsahovat ještě vyšší procento Δ9-THCP.

Dále je třeba zdůraznit, že existuje překvapující variabilita subjektivních reakcí pacientů na terapii na bázi konopí i při stejné dávce Δ9-THC. Je proto možné, že psychotropní účinky jsou způsobeny jinými extrémně aktivními fytokanabinoidy jako Δ9-THCP. Nikdo však tento potentní fytokanabinoid dosud v léčebných odrůdách konopí nehledal. Podle názorů autorů této studie by měla být tato sloučenina zařazena do seznamu hlavních fytokanabinoidů, které mají být stanoveny při správném vyhodnocení farmakologického účinku extraktů z konopí určených pacientům. Ve skutečnosti jsou autoři přesvědčeni, že objev tohoto extrémně potentního fytokanabinoidu podobného THC může osvětlit některé farmakologické účinky, které nelze připsat pouze Δ9-THC.

Probíhající studie se věnují zkoumání farmakologické aktivity CBDP a rozšiřování aktivity Δ9-THCP. Je známo, že CBD se váže na oba CB1 a CB2 receptory s nízkou afinitou. Proto se hodnocení kanabimimetické aktivity CBDP nezdá být prioritní, ačkoliv věda může přinést velká překvapení. Současná práce této vědecké skupiny je spíš zaměřena na testování pro CBD typických protizánětlivých, antioxidačních a antiepileptických aktivit.

Použité metody

V části Metody studie najdete detailní popis všech použitých výzkumných technik.

Informace o studii:

Publikováno: Scientific Reports, 2019

Anglický název: A novel phytocannabinoid isolated from Cannabis sativa L. with an in vivo cannabimimetic activity higher than Δ9-tetrahydrocannabinol: Δ9-Tetrahydrocannabiphorol

PMCID: PMC6937300 / PMID: 31889124

doi: 10.1038/s41598-019-56785-1

Autoři:

Cinzia Citti, Pasquale Linciano, Fabiana Russo, Livio Luongo, Monica Iannotta, Sabatino Maione, Aldo Laganà, Anna Laura Capriotti, Flavio Forni, Maria Angela Vandelli, Giuseppe Gigli,Giuseppe Cannazza

Pracoviště:

• Mediteknology spin-off company of the National Council of Research (CNR), Via Arnesano, 73100 Lecce, Italy
• Institute of Nanotechnology of the National Council of Research (CNR NANOTEC), Via Monteroni, 73100 Lecce, Italy
• Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Via Campi 103, 41125 Modena, Italy
• Department of Experimental Medicine, Division of Pharmacology, Università della Campania “L. Vanvitelli”, Via Santa Maria di Costantinopoli 16, 80138 Naples, Italy
• Department of Chemistry, Sapienza University of Rome, Piazzale Aldo Moro 5, 00185 Rome, Italy