CannaData

Konopí a kanabinoidy se po desetiletích prohibice stávají výnosným obchodním artiklem. Odhaduje se, že během příštích let bude mít konopný business jenom v USA dvojciferné miliardové parametry.

Je třeba si uvědomit, že konopí určené ke spotřebě (pro medicinální či rekreační využití) může obsahovat jak endogenní organické (kanabinoidy, terpenoidy, flavonoidy aj.), tak exogenní (mykotoxiny, pesticidy, herbicidy) sloučeniny. Kromě toho mohou jeho kvalitu ohrožovat těžké kovy, bakterie, plísně, houby a jiné toxické látky.

Nutnost důkladné chemické analýzy je pro bezpečné a co nejúčinnější využití konopí naprosto nezbytná.

Co je to hmotnostní spektrometrie a jak funguje?   

Tato analytická metoda převádí molekuly na ionty podle poměru hmotnosti a náboje. Díky tomu umožňuje zjistit hlavně:

• elementární složení látek, vzorků, molekul
• chemickou struktura molekul
• hmotnost částic

Autoři článku upozorňují, že se v konopném businessu často používají méně definitní techniky jako kapalinová chromatografie s detektorem s diodovým polem (LC/PDA) a plynová chromatografie s plamenovým ionizačním detektorem (GC/FID). Jako výrobci kombinovaných zařízení pro kapalinovou (LC/MS), resp. plynovou (GC/MS) chromatografii a hmotnostní spektrometrii akcentují jejich výhody a možnosti využití.

Proč by měla být hmotnostní spektrometrie součástí chemické analýzy konopí?

Účelem tohoto dokumentu je představit doporučení, proč by techniky hmotnostní spektrometrie měly být důležitou součástí chemické analýzy konopí. Záměrem není zdiskreditovat ostatní techniky, ale připomenout jejich rizika a přínosy jiných alternativních analytických technik.

Měření potence a složení kanabinoidů

Nejčastěji monitorovanými kanabinoidy jsou THC, CBD, THCA, CBDA a CBN. V obrázku 1 si můžete prohlédnout strukturu těchto sloučenin. Jak vidíte, jsou mezi nimi pozoruhodné podobnosti, ačkoliv jejich farmakologické vlastnosti se mohou dramaticky lišit. Obvykle měřenou veličinou konopných vzorků je jejich potence, hlavně z pohledu THC či CBD.

Je důležité si uvědomit, že různé odrůdy konopí obsahují širokou škálu dalších složek v odlišných poměrech. Chemická analýza je nutná pro zjištění přesného složení. I jinak velmi podobné kultivary se mohou rozcházet v obsahu účinných látek. Existují důkazy, že vzájemná synergie kanabinoidů a dalších sloučenin, jako jsou terpenoidy a flavonoidy, podporuje léčebný účinek. Takže tento tzv. entourage effect může být zásadní pro medicinální přínos.

V konopí bylo dosud odhaleno přes 500 chemických sloučenin včetně více jak 100 fytokanabinoidů a 120 terpenoidů. První otázkou je relativní množství hlavních kanabinoidů.

V kontrastu s moderními farmaceutickými LC/MS bio-analytickými stopovými analytickými technikami jsou některé z kanabinoidů v rostlině přítomné v relativně vysokých procentech. Je proto běžné konopné extrakty 100-1000x zředit, aby se snížila koncentrace kanabinoidů na úroveň vhodnou pro analytické kvantitativní stanovení. Aby se maximalizoval získaný objem informací, je třeba změnit tyto analytické postupy.

V konopném průmyslu v USA je aktuálně nejpopulárnější analytická metoda HPLC/PDA, vysokoúčinná kapalinová chromatografie s detektorem diodového pole. Tato technologie je oblíbená hlavně díky svému relativně snadnému a levnému použití. Podle zjištěných důkazů ale může její nevýhoda spočívat v tom, že neposkytuje kombinovanou citlivost a selektivitu detektoru hmotnostního spektrometru. Surový extrakt rostlinné látky bude obsahovat velké množství chemických složek. HPLC/PDA analýza bude pravděpodobně zahrnovat ko-elující chemické složky pod HPLC/PDA chromatografickým vrcholem.

Jak vidíte v Obrázku 2, plocha pod tímto vrcholem bude větší, než by byla, kdybych vrchol reflektoval pouze cílenou sloučeninu. Zvětšená plocha bude ukazovat určité množství kanabinoidu, které ale bude vyšší než je přítomné ve skutečnosti.

a) LC/UV (kapalinová chromatografie s UV) chromatogram vykazuje očekávané hojné vrcholy pro THC a THCA, ale také jiné neznámé chromatografické složky, které mohou interferovat s hodnocením množství jiných, nižších, hladin kanabinoidů. Četné vrcholy nízké úrovně v rozpětí 1.4 až 1.9 ztěžují selektivní kvantifikaci kanabinoidů, které se v této oblasti eluují. Měření bylo prováděno při vlnové délce 210 nm.

b) LC SIM/MS (Kapalinová chromatografie v režimu monitorování vybraného iontu) analýza monitoruje protonované molekuly pro cílené kanabinoidy CBDA, CBD, THC, THCA. Aby se jasně prokázala přítomnost nižších hladin pozorovaných pro CBD a CBDA byla osa Y zesílena 10x. Tento postup zvyšuje vrcholy THC a THCA mimo měřítko, ale také jasně ukazuje přítomnost CBDA a CBD, které byly u metody LC/UV zakryty. Toto měření bylo provedeno pomocí jednoduchého kvadrupólového hmotnostního spektrometru od firmy Advion, vybaveného elektrosprejovou ionizací.

Zvýšená selektivita techniky SIM LC/MS umožňuje monitorovat pouze protonové molekuly cílového kanabinoidu a tak dosáhnout přesnějších výsledků. Ještě vyšší selektivity by bylo možné získat s přesnějšími hmotnostními spektrometry. Narozdíl od HPLC/PDA by mohla výrazně vyšší selektivita hmotnostních spektrometrů usnadnit kvalitativní identifikaci neznámých sloučenin. Současně by mohla také zmírnit potenciál neočekávaných chemických interferencí při kvantitativním stanovení cílové sloučeniny.

Podle autorů textu většina současných metod používaných pro testování účinnosti pomocí HPLC/PDA využívá kalibrační křivku se vzorky a standardy pro kontrolu kvality ve vodě nebo alkoholových rozpouštědlech. Chybí u nich jakékoliv složky rostlinné matrice. Tento přístup je v rozporu s moderními bio-analytickými technikami. Údaje tak mohou být z mnoha důvodů chybné.

Proč je třeba monitorovat i terpenoidy?

Terpenoidy jsou spoluzodpovědné nejen za vůni konopí. Vzájemnou synergií s dalšími sloučeninami se díky entourage efektu podílí i na některých léčivých účincích. Právě tyto jedinečné kombinace vyžadují chemickou analýzu, která zaručí odhalení co nejpřesnějších léčebných účinků u konkrétních odrůd a konopných typů.

Chemická analýza terpenů se obecně provádí metodou kapilární chromatografie GC/FID a poslední dobou i pomocí GC/MS nebo LC/MS/MS, kapalinové chromatografie se zdvojeným hmotnostním spektrometrem). Dvě poslední metody se zdají být nejvhodnější technikou.

Měření jedovatých látek ve vzorcích konopí

V některých státech USA je konopí legalizováno pro lékařské i rekreační užití. Tím roste stále větší význam bezpečnostních předpisů pro prodej kanabinoidních produktů. Zdravotní nezávadnost konopí a výrobků z konopí obsahující je ohrožena mj. pesticidy a herbicidy. Testování vzorků z prodejen neustále odhaluje produkty kontaminované insekticidy, herbicidy, rodenticidy a dalšími ochrannými prostředky proti hmyzu nebo bakteriím.

Hmyzí a bakteriální škůdci se objevují i přesto, že pěstitelé konopí pěstují uvnitř chráněných a technologicky vybavených skleníků. Hmyz a bakterie nepříznivě ovlivňují růst i kvalitu rostlin. Zarážející je, že zbytky pesticidů byly objeveny i ve vzorcích konopí z lékařských trhů ve státech Colorado a Washington.

Riziko nežádoucích zdravotních účinků vzniklých z nepřesného testování by se nemělo bagatelizovat. Například, někteří legální pěstitelé používají perzistentní fungicid myklobutanil. Pokud zůstane v sušeném konopí a je zahříván (např. zapálením cigarety), uvolňuje se toxický plyn kyanovodík. Regulační kontrola a spolehlivá chemická analýza rostlinného materiálu před spotřebou zajistí, aby se takto degradovaný produkt na trh a ke spotřebiteli vůbec nedostal.

Autoři textu uvádějí, že technologie LC/MS/MS je doporučována většinou státních laboratoří ke kvantitativnímu stanovení pesticidů v konopí a produktech z něj odvozených. Tato technologie spojená s doporučenou přípravou vzorku poskytuje široké pokrytí s vysokou citlivostí a selektivitou pro kvantitativní stanovení více než 100 pesticidů.

Pozor na těžké kovy

Rostliny konopí mají pozoruhodné schopnosti odstraňovat těžké kovy z půdy. To může dobře posloužit, pokud se pěstují komerčně jiné plodiny. V případě, že je konopí ale využíváno pro další potravinářské nebo medicinální zpracování, může přítomnost těžkých kovů ohrozit zdraví konzumenta.

Konopí v USA je běžně testováno na přítomnost olova, kadmia, arsenu a dalších. Těžké kovy lze monitorovat pomocí atomové absorpce (AA), optickou emisní spektroskopií s indukčně vázanou plazmou (ICP-OES) a hmotnostní spektrometrií s indukčně vázanou plazmou (ICP-MS).

Techniky ICP-OES a ICP-MS jsou komplexnější, protože jsou schopny měřit více prvků současně. Tyto metody se liší dále v citlivosti. ICP-MS nabízí nejlepší citlivost a také proto se už běžně využívá v mnoha moderních laboratořích.

Organokovové sloučeniny se dají nejvhodněji detekovat pomocí kombinované techniky LC/ICP/MS.

Mikrobiologická kontaminace, mykotoxiny a další nebezpečné látky

I konopí pěstované v relativně kontrolovaných podmínkách může být kontaminováno celou řadou bakterií a hub. Ohrožena je nejen sušina ke kouření, ale i všechny produkty vyrobené z nekvalitního konopí. V současnosti nemusí prodejci v amerických státech mikrobiologické testování provádět.

Mykotoxiny jsou sekundární metabolity plísní s vysokou toxicitou. Vznikají hlavně při dlouhodobém skladování konopí. Mají karcinogenní účinky a jejich přítomnost prakticky vylučuje takto postižené konopí ze spotřeby. Podle autorů textu jsou vhodnými kandidáty pro měření techniky LC/MS a LC/MS/MS.

Problémem mohou být i zbytková rozpouštědla. Testování na jejich přítomnost se v současnosti provádí pomocí GC/FID. Zatím se neuvažuje, že by mohla být nahrazena hmotnostní spektrometrií, hlavně z důvodů odlišných nákladů.

Hmotnostní spektrometrie s poměrem izotopů (IRMS) může být použita jako forenzní nástroj ke stanovení geografického původu rostliny.

Hmotnostní spektrometrie při biologické analýze vzorků a forenzní toxikologii

Analýzy biologických vzorků pro kvantitativní stanovení kanabinoidů nebo jejich metabolitů většina amerických státních laboratoří neprovádí. Tyto aplikace by přitom pomohly určit, zda konopí přispělo k pozorované toxicitě nebo by mohly být využity pro účely forenzní toxikologie při určování protiprávního užití látek, které mění výkon. Například při kontrolování řidičů automobilů, zda jsou pod aktivním vlivem psychoaktivních kanabinoidů.

Nepsychoaktivní THC-COOH je hlavní sekundární metabolit THC, který se tvoří v těle po konzumaci konopí. V těle může být zpravidla detekován jen několik dní v závislosti na dávce a způsobu podávání. Naproti tomu THC může u chronických kuřáků v těle vydržet mnohem déle. Některé studie tvrdí, že existuje jen malá korelace mezi THC v krvi a poruchou řízení. Vzhledem k obvyklému několika hodinovému zpoždění mezi incidentem a laboratorním testováním vzorku je rozhodování o tom, zda byl řidič pod vlivem nebo ne, velmi ztížené.

Potenciální řešení vidí autoři textu v mikro odběru vzorků pomocí suchých krevních skvrn (DBS) a suchých plazmatických skvrn (DPS) hned po nehodě nebo při podezření na jízdu pod vlivem. Výhodou je minimalizace zpoždění a stabilizace THC a jeho metabolitů ze suchých vzorků. Snadno odebraný vzorek krve z prstu se nechá 20 minut sušit a pak se odešle do laboratoře, kde se vzorek analyzuje pomocí SRM LC/MS (hmotnostní spektrometrie a kapalinová chromatografie v režimu monitorování vybrané reakce).

Je pravděpodobné, že budoucí řešení pro odběr vzorků biologických tekutin se bude orientovat právě na techniky chemické bioanalýzy zahrnující LC/MS/MS nebo LC s vysokým rozlišením.

Shrnutí poznatků

Je jisté, že se vzrůstajícím objemem konopného průmyslu existuje čím dál naléhavější potřeba pro přesnou chemickou analýzu velkého počtu vzorků. Od rostlinných materiálů po konečné produkty včetně léčivých přípravků a potravin. Metody kombinované hmotnostní spektrometrie mohou být velice precizním a efektivním nástrojem pro dosažení tohoto cíle.

Uživatelé produktů by měli být ujištěni o přítomnosti a úrovni všech přítomných látek bez výskytu toxických chemikálií a jiných zdraví ohrožujících látek. Autoři textu zdůrazňují, aby se zajistila co nejlepší kombinace selektivity a citlivosti vyžadovaná chemickou složitostí a rozmanitostí rostliny. Jedině tak budou moci konopné produkty splňovat nejvyšší nároky na bezpečnost.

Samozřejmým předpokladem je kromě moderních analyticko-chemických metod a standardních operačních postupů nebo přísně validovaných metod také vysoká odbornost analytických chemiků.

Náhledové foto pochází z webu Advion.

Informace o článku:

Publikováno: Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2019

PMID: 30993637, PMCID: PMC6502781

https://doi.org/10.1007/s13361-019-02164-z

Anglický název: The Role of Mass Spectrometry in the Cannabis Industry

Autoři: Ben Nie, Jack Henion, Imelda Ryona, společnost Advion