CannaData

Terpeny koncentrované v trichomech definují některé unikátní organoleptické (smyslové) vlastnosti a současně mohou ovlivňovat i léčivé účinky. Spolupůsobení terpenů s kanabinoidy a dalšími sloučeninami v rostlině konopí je známo jako Entourage Effect. Také platí, že oproti kanabinoidům jsou terpeny méně prozkoumány.

Znalost genové rodiny terpenových syntáz v konopí Cannabis sativa (CsTPS) může pomoci s vývojem standardizovaných profilů terpenů s ohledem na léčebné i rekreační účely.

Stručné shrnutí výsledků výzkumu trichomů odrůdy ‘Finola’

• Transkripční analýza odhalila sekvence všech fází terpenové biosyntézy.
• Transkripty spojené s biosyntézou terpenů jsou vysoce exprimovány v trichomech oproti tkáním, které žádnou pryskyřici neprodukují.
• V podrodech TPS-a a TPS-b bylo identifikováno devět terpenových syntáz konopí.
• Funkční charakterizace identifikovala mono- a seskvi-TPS, jejichž produkty společně obsahují většinu terpenů pryskyřice ‘Finola’, včetně hlavních sloučenin, jako je β-myrcen, (E) -β-ocimen, (-) - limonen, (+) -α-pinen, β-karyofylen a α-humulen.

Úvod do studie

Žlázové trichomy se vyskytují hojně na samičích květenství a kromě toho, že mají ochrannou funkci, jsou zodpovědné také za produkci a akumulaci silic a pryskyřic bohatých na některé kanabinoidy a terpeny. V závislosti na fázi života mění barvu. Mléčně zabarvené trichomy jsou znakem dozrávání.

Fytokanabinoidy patří mezi třídu terpenofenolických metabolitů. Tyto sloučeniny se primárně nachází v pryskyřici produkované právě ve žlázových trichomech. Obrázek 1 znázorňuje květenství v pátém týdnu květu a celou řadu monoterpenů a seskviterpenů, které jsou z velké míry zodpovědné za vůni květů a charakteristicky přispívají k unikátním chuťovým vlastnostem konopí.

Květová část (vlevo) má vysokou hustotu žlázových trichomů. Naproti tomu u listů (vpravo) je hustota mnohem nižší. V horní řadě jsou napsány monoterpeny, ve střední řadě seskviterpeny a ve spodní řadě kanabinoidy CBGA (kyselina kanabigerolová), THCA (kyselina tetrahydrokanabinolová) a CBDA (kyselina kanabidiolová).

Interakcím mezi terpeny a kanabinoidy byly připisovány rozdíly mezi farmaceutickými vlastnostmi různých odrůd. Podle E.B. Russoa mohou terpeny přispívat k anxiolytickým, antibakteriálním, protizánětlivým a sedativním účinkům.

Terpenová biosyntéza probíhající v rostlinách zahrnuje dvě dráhy k produkci obecných 5-uhlíkových isoprenoid difosfátových prekurzorů všech terpenů. Dráhu plastidiálního methylerythritol fosfátu (MEP) a dráhu cytosolického mevalonátu (MEV). Tyto dráhy regulují různé zásoby substrátů dostupných pro terpenové syntázy (TPS). MEP se skládá ze sedmi kroků, v jejichž průběhu se pyruvát a glyceraldehyd-3-fosfát konvertují na isopentenyl difosfát (IPP) a dimethylallyl difosfát (DMAPP). Viz Obrázek 2A.

Tučně uvedené kroky (část A) byly zahrnuty do qPCR analýzy (část B) relativního množství transkriptů. Písmena uvnitř grafu označují výrazně odlišné změřené průměry mezi tkáněmi v každém z testovaných genů. Tr = trichomie; Le= list; Sf= stamenátový květ; Ro = kořen; Sm = stonek.

Enzymy považované pro regulaci toku za kritické skrz tuto dráhu zahrnují první dva a poslední dva kroky:

• 1-deoxy-D-xylulózo-5-fosfát syntáza
• 1-deoxy-D-xylulózo-5-fosfát reduktáza
• 4-hydroxy-3- methylbut-2-enyl difosfát syntáza
• 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl difosfát reduktáza

MEV dráha převádí tři jednotky acetyl-CoA na IPP, který je pak pomocí IPP izomerázy izomerován na DMAPP. Krokem, který omezuje rychlost v této šestistupňové dráze je 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reduktáza, která produkuje mevalonát. IPP a DMAPP jsou kondenzovány prenyltransferázami na isoprenoidové difosfáty s dlouhým řetězcem. Tyto prenyltransferázy zahrnují geranyl difosfát (GPP) syntázu (GPPS) a farnesyl difosfát (FPP) syntázu (FPPS).

GPPS a FPPS kondenzují jednu jednotku IPP a jednu nebo dvě jednotky DMAPP, aby zformovaly 10- a 15-uhlíkových lineárních trans-isoprenoid difosfátů. GPP je 10-uhlíkový prekurzor monoterpenů a je obyčejně derivován z 5-uhlíkových isoprenoid difosfátových jednotek skrze MEP dráhu. GPP je také stavebním blokem v biosyntéze kanabinoidů. FPP je 15-uhlíkový prekurzor seskviterpenů a obvykle se tvoří z 5-uhlíkových isoprenoid difosfátových jednotek při MEV dráze.

GPPS existují jako homo- nebo heterodimerní enzymy. U nejbližšího známého příbuzného konopí, chmele, mohou heterodimerní GPPS produkovat jak GPP, tak 20-uhlíkový geranylgeranyl difosfát (GGPP), s poměrem velkých a malých podjednotek G(G)PPS. Lineární isoprenoid difosfáty GPP a FPP jsou substrátem pro syntázu monoterpenů (mono-TPS) a syntázu seskviterpenů (seskvi-TPS). Respektive, diverzifikují tyto prekurzory do velkého počtu různých mono- a seskviterpenů.

TPS jsou obvykle v rostlinách zakódovány ve velkých a rozmanitých genových rodinách. Přispívají k obecnému i specializovanému metabolismu. Rodina rostlinných TPS genů byla anotována šesti podrodinami. V angiospermech je tvořena podrodina TPS-b typicky tvořena mono-TPS. TPS-a enzymy jsou často seskviterpeními syntázami. TPS vytváří cyklické a acyklické terpeny prostřednictvím karbokatických meziproduktů, stvořených dvojmocnou kovovou kofaktorovou eliminací difosfátu. Reaktivní kationtový meziprodukt může podléhat cyklizaci a přeskupení, dokud není reakce zastavena deprotonací nebo zachycením vody. Mnoho TPS vytváří více produktů ze stejného substrátu.

Terpenové složení konopné pryskyřice se podstatně liší v závislosti na genetických, enviromentálních a vývojových faktorech. Koncentrace a poměry kanabinoidů jsou u různých kmenů relativně předvídatelné. Naproti tomu terpenové profily jsou předvídatelné méně, nebo jsou zcela neznámé.

Aby se daly selektovat a vylepšovat konopné odrůdy s požadovanými terpenovými profily, je nutné identifikovat geny zodpovědné za terpenovou biosyntézu. Toho lze dosáhnout využitím dostupných zdrojů konopných transkriptomů a genomů. Genomy a transkriptomy pro kmen Purple Kush a odrůdu technického konopí ‘Finola’ byly navrženy a publikovány už dříve. Tyto zdroje byly v rámci této studie použity k prozkoumání exprese genů zahrnutých ve všech fázích biosyntézy terpenů. Studie identifikovala devět modelů TPS genů v transkriptomu odrůdy ‘Finola’. TPS geny a genové transkripce v MEP a MEV dráhách byly vysoce exprimovány v rostlinných trichomech. Výzkum identifikoval biochemické funkce TPS, vysoce exprimované v odrůdě ‘Finola’. Charakterizované TPS enzymy představují většinu terpenů nalezených v pryskyřici pocházející z odrůdy technického konopí ‘Finola’.

Použité materiály a metody

Rostlinné materiály   

Semínka odrůdy ‘Finola’ pocházely od společnosti Alberta Innovates Technology Futures. Rostliny byly vypěstovány v pěstební komoře pod licencí Health Canada. Po vyklíčení se semena přenesla z filtračního papíru do směsi substrátu (Sunshine Mix #4) a perlitu v poměru 4:1. Fluorescenční zářivky svítily 16 hodin denně, při okolní teplotě 28° C. Asi dva týdny po vyklíčení bylo třeba sazenice přenést do větších květináčů. Všechny rostliny byly následně vyživovány pomocí univerzálního hnojiva (Miracle-Gro) s poměrem dusíku, fosforu a draslíku (NPK) 24-8-26.

Extrakce terpenů

Na extrakci byla použita shromážděná pestíková květenství zbavená listů a stonků. Všechny květy z jednotlivé rostliny se sloučily. Kvůli stanovení čerstvé hmotnosti se zvážily vzorky tkáně o hmotnosti cca 0,2 g. Třícyklová extrakce v 1 ml pentanu trvala za mírného třepání a při pokojové teplotě 1 hodinu. Jako vnitřní standard byl přidán isobutyl benzen. Po třech extrakcích nebyly ve čtvrté extrakci rozpouštědlem identifikovány už žádné terpeny. Rostlinná tkáň se sušila přes noc a pak byla zvážena kvůli stanovení suché hmotnosti. Všechny tři pentanové extrakty byly sloučeny pro potřeby analýzy do celkového 3 ml objemu.

Izolace trichomu

Už dříve bylo popsáno, že hlavy glandulárních trichomů byly izolovány z celých květenství bez XAD-4, ale s přídavkem 5 mM kyseliny aurintrikarboxylové v izolačním pufru. Místo buněčného disruptoru byla květinová tkáň vířena skleněnými kuličkami ve Falcon zkumavce tak, aby se odstranily hlavy trichomu. Po víření byly trichomy odstraněny od kuliček a zelené tkáně filtrací pomocí jemné nylonové síťky (105 μm). Jemné odstředění v ledovém pufru zajistilo shromáždění trichomů. Supernatant byl odstraněn pipetou a peleta trichomů byla okamžitě zamrazena pomocí tekutého dusíku.

Analýza metabolitů

Analýza rostlinných extraktů proběhla pomocí plynové chromatografie (GC) a hmotnostního spektrometru (MS). Sloučeniny byly identifikovány porovnáním retenčního indexu a hmotnostního spektra s autentickými standardy. K dispozici byly standardy pro všechny monoterpeny a následující seskviterpeny: β-karyofylen, α-humulen, farnesol, valencen, germakren D a allo-aromadendren.

Nezávazná identifikace všech ostatních seskviterpenů byla provedena srovnáním retenčního indexu a hmotnostního spektra s knihovnou NIST (National Institute of Standards and Technology).

Identifikace bergamotenu, δ-selinenu a farnesenu byly posíleny porovnáním s esenciálními oleji odrůdy Bergamot (Citrus bergamia) a pimentovníku (Pimenta racemose). Chiralita byla určena retenčním indexem a porovnáním s autentickými standardy.

Klonování cDNA a charakterizace TPS genů

Celková RNA byla izolována z květů, listů, stonků a kořenů odrůdy ‘Finola’ pomocí činidla Invitrogen PureLink Plant RNA. Kvalita a koncentrace RNA se měřila pomocí testu Bioanalyzer od společnosti Agilent. cDNA byla syntetizována pomocí soupravy na reverzní transkriptázu Superscript III. Viz Tabulka S1.

Transformace Nicotiana benthamiana a přechodná exprese

Kódovací sekvence CsTPS5FN byla vložena do expresního vektoru pEAQ-GG rostliny Golden Gate, který obsahuje promotor CaMV 35S. Tento konstrukt a supresorový tlumící gen p19 byly transformovány do kmene Agrobacterium tumefasciens AGL1. Po vypěstování byl A. tumefasciens infiltrován do abaxiální strany čtyřtýdenních rostlin N. benthamiana. Infrilgrované rostliny byly pěstovány ve tmě po dobu tří dnů. Jejich listy byly sklizeny, zpracovány v TPS pufru a následně podrobeny testům enzymatické aktivity.

RT-qPCR analýza hojnosti transkripcí

cDNA pro qPCR byla syntetizována pomocí soupravy Maxima First Strand cDNA synthesis kit podle pokynů výrobce (Thermo Fisher). Seznam primerů navržených pomocí Primer3 softwaru je k prohlédnutí v externí Tabulce S2. Referenční geny byly vybrány pomocí geNorm a analyzovány softwarem qBase+.

• Jako referenční geny pro RT-qPCR časných isoprenoidových biosyntéz napříč různými rostlinými orgány byly použity aktin a CDK3.
• Pro RT-qPCR transkriptů TPS v trichomech byly použity referenční geny CDK3 a GAPDH.
• RT-qPCR analýzy byly provedeny se čtyřmi biologickými a dvěma technickými replikacemi pro časné isoprenoidové biosyntetické transkripce v různých orgánech.
• Pro TPS transkripční analýzu v trichomech byly provedeny tři biologické a tři technické replikace.
• Exprese genů byla analyzována pomocí qBase+.
• Statistickou analýzu (na hojnost log-transkriptů s Bonferroniho korekcí) provedl software ANOVA.

Predikce TPS genů a fylogeneze

Sestavy genomů a transkriptomů odrůdy ‘Finola’ byly staženy z prohlížeče konopných genomů (http://genome.ccbr.utoronto.ca/cgi-bin/hgGateway). Tyto sestavy byly použity jako předmět vyhledávání tBLASTn pomocí 71 TPS genů stažených z GenBank a Phytozome. Viz Tabulka S3.

Predikce genů a sestřihových míst byla provedena na skafoldech obsahujících oblasti vykazující podobnost s TPS sekvencemi pomocí algoritmu predikce Exonerovaných genů. Také byl použito předběžné sestavení genomu Purple Kush založené na sekvenčních datech dle PacBio. Predikované geny byly ručně kuratovány proti dřívějším sekvenčním datům Purple Kush a zkoumány kvůli prokázání otevřených čtecích rámců, start-kodonům a stop-kodonům.

Maximálně pravděpodobná fylogeneze byla vytvořena pomocí webové aplikace fylogeny.fr. Seřazení použité pro vstup bylo vytvořeno MUSCLE algoritmem se všemi translatovanými sekvencemi aminokyselin z predikovaných genových TPS modelů z konopí a 71 publikovaných TPS sekvencí uvedených výše.

Výsledky

Terpenové profily v květenství konopí

K prozkoumání terpenových profilů z pestíků květů byla použita odrůda technického konopí ‘Finola’ vypěstovaná ze semínek. Tato odrůda byla vybrána proto, že už dříve byly publikovány referenční návrhy jejích genomových a transkriptomových sestav.

Pestíky z květů mající nejvyšší hustotu žlázových trichomů z celé rostliny byly použity jako vzorek, který měl pokrýt časnou až střední fázi květu (mezi 3. a 8. týdnem od začátku květu). Začátek květu dle definice nastává, když se objeví první pestíky.

Nezávisle na fázi květu se ukázaly jako nejhojnější tyto monoterpeny:

• myrcen
• (+)-α-pinen
• (-)-limonen
• (+)-β-pinen
• terpinolen
• (E)-β-ocimen

Nejhojnějšími seskviterpeny nezávisle na fázi květu:

• β-karyofylen
• α-humulen
• bergamoten
• farnesen

Jak ukazuje Tabulka 1, profily terpenů ze vzorků celkem 22 samostatných rostlin vykazovaly mezi jednotlivými rostlinami značné rozdíly.

U jednotlivých metabolitů nebyly pozorovány žádné trendy v závislosti na vývoji květenství. Celkové množství monoterpenů se při dozrávání květenství v porovnání se seskviterpeny zvýšilo. Čtvrtý týden od začátku květu měly rostliny průměrný obsah 389 μg g1 DW monoterpenů a 34 μg g1 DW seskviterpenů.

Těžba transkriptomů časných genů biosyntézy isoprenoidů

Dotazování směřovalo na transkripty zapojené v časných fázích biosyntézy isoprenoidů u transkriptomu ‘Finola’. Kombinovaly se 4 transkripční sady stažené z Cannabis Genome Browser, včetně transkriptů z vyvíjejících se semen, zralých pestíkových květů, tyčinek (samčích) květů a celých sazenic. Při hledání translatovaných nukleotidových sekvencí z odrůdy ‘Finola’ pomocí aminokyselinových sekvencí z Vitis vinifera a Arabidopsis thaliana byl použit algoritmus tBLASTn.

Byl nalezen alespoň jeden transkript celé nebo téměř celé (>95%) délky pro každý z hlavních genů v MEP a MEV drahách a lineárních isoprenoid difosfátových prenyltransferázách. Viz Obrázek 2B.

Geny zahrnuté do analýzy MEP dráhy:

• 1-deoxy-D-xylulóza-6-fosfátová (DOXP) syntáza (DXS)
• DOXP reduktooizomeráza (DXR)
• 2-C-methyl-D-erythritol cytidyltransferáza (MCT)
• 4 -difosfátcytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kináza (CMK)
• 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl difosfát (HMB-PP) syntáza (HDS)
• HMB-PP reduktáza (HDR)

Byly odhaleny dvě verze DXS, CsDXS1 a CsDXS2, které jsou na úrovni aminokyselin ze 62,8% identické. Ve fylogenii, CsDXS1 klastry s členy DXS podrodiny DXS-I jiných rostlinných druhů, a CsDXS2 klastry s členy DXS-II podrodiny. Viz Příloha S1.

Geny zahrnuté do analýzy MEV dráhy:

• 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) syntáza (HMGS)
• HMG-CoA reduktáza (HMGR)
• mevalonát kináza (MK)
• fosfo-mevalonát kináza (PMK)
• mevalonát-5-fosfát dekarboxyláza (MPDC)
• IPP isomeráza (IDI)

Byl nalezen alespoň jeden transkript odpovídající každému enzymu. Byly nalezeny dva transkripty pro HMGR, HMGR1 a HMGR2, které jsou na úrovni aminokyselin ze 72,7% identické.

Jako kandidátské prenyltransferázy byly nalezeny transkripty heterodimerního systému GPPS podobné těm, které jsou charakteristické pro chmel, s velkou GPPS (GPPS.Isu) a malou (GPPS.ssu) podjednotkou. Byly identifikovány dva FPPS odpovídající transkripty, na úrovni aminokyselin z 80,3% identické.

RT-qPCR expresní analýza isoprenoidních biosyntetických transkriptů

K posouzení genové exprese isoprenoidové biosyntézy napříč různými částmi rostliny konopí byly použity qRT-PCR, aby se zkoumala hojnost transkripcí prenyltransferáz a klíčové geny v MEP a MEV drahách. Vybrali se geny pro tři kroky v MEP drahách (DXS, DXR, HDR) a dva geny MEV drah (HGMR, IDI).

Zahrnuty byly  také dva FPPS geny. V heterodimerní GPPS je rychlost GPP biosyntézy řízena poměry malých a velkých podjednotek. Vyšší poměry malých k velkým podjednotkám vedou k vyšší tvorbě GPP. Transkripční úrovně byly stanoveny v listech, stoncích, kořenech, staminátových květech a grandulárních trichomech z pestíkových květů. Pestíkové květy byly sklizeny mezi 10-12 týdnem po vyklíčení.

CsDXS1 byl exprimován ve všech vzorcích, bez významných rozdílů mezi různými částmi rostlin. Viz Obrázek 2B. CsDXS2 byl exprimován také ve všech vzorcích. Úrovně transkriptů CsDXS1 a CsDXS2 se významně nelišily kromě kořenů, kde průměrné hladiny CsDXS2 byly 14 krát hojnější než CsDXS1.

Také HMGR1 a HMGR2 byly exprimovány v každém vzorku. Jejich četnost transkriptů se významně nelišila, s výjimkou listů a kořenů, kde byl HMGR výrazně více exprimován. Četnost FPPS transkripcí v kořenech a staminátových květech byla mezi dvěma FPPS geny signifikantně odlišná. Geny dráhy MEP, DXR a HDR, byly exprimovány významně více v trichomech a listech. Konopné listy sice obsahují žlázové trichomy, ale s mnohem menší hustotou než na květech. Geny v MEP dráze byly také více exprimovány v trichomech a listech, než geny MEV dráhy. Transkripty GPPS.ssu byly mnohem hojnější (>25 krát vyšší) ve srovnání s jinými tkáněmi.

Členové TPS genové rodiny konopí

V transkriptomu odrůdy ‘Finola’ bylo identifikováno devět úplných nebo téměř úplných (předpokládáno >95% délky aminokyseliny) a šest částečně předpokládaných TPS genů (CsTPS FN). Maximální pravděpodobnost fylogeneze devíti úplných CsTPSFN predikovaných proteinových sekvencí a reprezentativních TPS z jiných rostlinných druhů umístila CsTPSFN navzájem nejblíže k sobě a s TPS z chmele (HISTS1 a HISTS2), což naznačuje nedávnou expanzi TPS genů v čeledi Cannabaceae (Konopovité). Viz Obrázek 3.

V rámci podrodin TPS-A a TPS-b jsou TPS z Cannabaceae, včetně konopí a chmele, těsněji propojeny navzájem s ostatními než s TPS z jiných angiospermů. TPS konopí jsou vyznačeny tučně. Kmen nebo odrůda konopí jsou označeny dvěma písmeny FN (‘Finola’), SK (Skunk), PK (Purple Kush). Přípona „S“ = syntáza.

TPS jiných zahrnutých druhů pochází z:

• Pp:Physcomitrella patens
• Os: Oryza sativa
• Cm: Cucurbita maxima
• At: Arabidopsis thaliana
• Cb: Clarkia breweri
• Ag: Abies grandis
• Pa: Picea abies
• Fa: Fragaria ananassa
• Am: Antirrhinum majus
• Mp: Mentha x piperita
• Rc: Ricinus communis
• Ci: Cichorium intybus
• Sl: Solanum lycopersicum
• Nt: Nicotiana tabacum
• Le: Lycopersicum esculentum
• Ga: Gossypium arboreum
• St: Solanum tuberosum
• Vv: Vitis vinifera
• Hl: Humulus lupulus
• So: Salvia officinalis
• Cl: Citrus limon
• Ms: Mentha spicata
• Pf: Perilla frutescens

Pět z devíti CsTPSFN (CsTPS1FN, CsTPS2FN, CsTPS3FN, CsTPS5FN, CsTPS6FN) se seskupilo s členy podrodiny TPS-b.

Zbývající čtyři (CsTPS4FN, CsTPS7FN, CsTPS8FN, CsTPS9FN) se seskupily do podrodiny TPS-a.

Dva CsTPSFN TPS-B geny (CsTPS1FN a CsTPS2FN) kódují predikované proteiny, které byly z 98,7% a 93,8% identické s dříve uváděnými CsTPS1 a CsTPS2. Byly identifikovány jako (-)-limonen syntáza (CsTPS1) a (+)-α-pinen syntáza (CsTPS2).

Funkční charakterizace členů podrodiny CsTPSFN TPS-b

CsTPSFN byly klonovány jako cDNA z květových pestíků ‘Finola’ nebo syntetizovány pro heterologní expresi a identifikaci produktových profilů kódovaných enzymů. Z cDNA byly klonovány 4 členové z rodiny TPS-b (CsTPS1FN, CsTPS2FN, CsTPS5FN a CsTPS6FN). CsTPS3FN nebylo možné z cDNA klonovat, proto byl získán jako syntetická cDNA.

Pro srovnání byly syntetizovány také tři sekvence TPS-b z trichomového transkriptomu (CsTPS13PK, CsTPS30PK, CsTPS33P). Těchto pět CsTPS z ‘Finola’ a tři z Purple Kush byly exprimovány jako rekombinantní proteiny a pak testovány na aktivitu s GPP, FPP a s produkty identifikovanými pomocí GC-MS analýzy. Viz Obrázek 4, Tabulka 2, Příloha S2 a Příloha S3.

Černé stopy ukazují celkový iontový chromatogram GC-MS z CsTPS testování GPP. Zelená stopa, tečkovaná čára, je reprezentativní terpenový profil z květenství ‘Finola’.

• a) ukazuje reprezentativní chromatogramy šesti TPS a květinový ‘Finola’ extrakt zpracovaný na koloně HP-5 GC.
• b) ukazuje reprezentativní chromatogramy z CsTPS2FN zpracované na koloně SB-Wax GC

Vrcholy:

• a) α-pinen
• b) camphen
• c) sabinen
• d) β-pinen
• e) myrcen
• f) α-terpinen
• g) limonen
• h) (Z)- β-ocimen
• i) (E)-β-ocimen
• j) γ-terpinen
• k) terpinolen
• l) β -felandren
• m) isoterpinolen
• i.s. = internal standard

Hlavním produktem CsTPS1FN byl (-)-limonen, s vedlejšími produkty (+)-α-pinen, camphen, (+)-β-pinen, a myrcen.

CsTPS2FN produkoval většinou (+)-α-pinen, s vedlejšími produkty (+)-β-pinen, myrcen, (-)-limonen, β-felandren a monoterpen předběžně identifikovaný jako isoterpinolen.

CsTPS3FN produkoval při inkubaci s GPP jako jediný detekovatelný produkt pouze myrcen. Také CsTPS30PK produkoval při testování s GPP jenom myrcen. Tyto dvě jednorázové myrcenové syntázy sdílejí pouze 54,5% aminokyselinové identity.

CsTPS5FN také produkoval jako svůj nejhojnější monoterpenový produkt myrcen (37%), ale na rozdíl od CsTPS3FN a CsTPS30PK, CsTPS5FN produkoval čtyři další monoterpeny: α-pinen (23%), (-)-limonen (17%), sabinen (15%), and (-)-β-pinen (8%). Stejný produktový profil byl zaznamenán, když byl CsTPS5FN přechodně exprimován v N. benthamiana - viz Příloha S4.

CsTPS5FN byl mezi členy podrodiny TPS-b poněkud neobvyklý, protože chyběla jakákoli zřejmá N-koncová plastidiální zaměřovací sekvence. Po inkubaci s FPP vyprodukoval také CsTPS5FN menší množství farnesenu. To z něj činí jediný člen podrodiny TPS-b, který produkoval detekovatelné seskviterpeny.

S GPP produkoval CsTPS6FN 97% (E)-β-ocimen a 3% (Z)-β-ocimen. TPS sekvence nalezená v Purple Kush, CsTPS13PK, sdílí 95,5% identity sekvence aminokyseliny s CsTPS6FN a produkoval 94% (Z)-β-ocimen. Třetí TPS z Purple Kush, CsTPS33PK, vytvářela dva různé monoterpeny: α-terpinen (61%) a γ-terpinen (39%).

Funkční charakterizace členů podskupiny CsTPSFN TPS-a

Čtyři členové TPS-a rodiny klonované jako cDNA z ‘Finola’ (CsTPS4FN, CsTPS7FN, CsTPS8FN, CsTPS9FN) byly exprimovány jako rekombinantní proteiny, proteiny testované s GPP a FPP a produkty identifikované pomocí GC-MS. Viz Obrázek 5A, Tabulka 2.

CsTPS4FN produkoval především alloaromadendren (52,3% z produktů celkem) s FPP. Viz Obrázek 5C. Zbývající produkty jsou směsí pěti seskviterpenových olefinů a dvou alkoholů, včetně valencenu, α-humulenu a produktu předběžně identifikovaného jako palustrol. CsTPS4FN byl aktivní s GPP a produkoval menší množství myrcenu. Viz Příloha S5.

CsTPS7FN produkoval 21 seskviterpenových olefinů a dva seskviterpenové alkoholy. Produkty předběžně identifikované jako δ-selinen a selina-6-en-4-ol tvořily 20,5% a 13,9% z produktového profilu. Velmi málo testovaných vzorků ‘Finola’ obsahovalo menší množství produktů CsTPS7FN. Viz Obrázek 5A. Každý zbývající vedlejší produků tvoří <10% z celkového počtu seskviterpenových produktů. Po inkubaci s GPP produkoval CsTPS7FN myrcen a limonen.

Nejhojnější produkt CsTPS8FN byl původně identifikován jako β-elemol (Viz Příloha S6), který často bývá artefaktem tepelně indukovaného přesmyku. Při nižší injekční teplotě 40° C nebyl produkt β-elemol dále detekován a byl nahrazen vrcholy korespondujícími s 11 seskviterpenovými olefiny a třemi seskviterpenovými alkoholy. Z nich byly dva hlavní produkty identifikovány jako γ-eudesmol (19.8%) a valencen (19.6%). Po inkubaci CsTPS8FN s GPP byly detekovány myrcen a limonen.

CsTPS9FN produkoval β-karyofylen a α-humulen z FPP. Tyto dva terpeny jsou vždy nejhojnější seskviterpeny v terpenovém profilu konopné pryskyřice. CsTPS9FN enzym vytváří tyto dva seskviterpeny v poměru přibližně 2,5/1. Což je podobné poměru (2,4 +/- 0.2 k 1) pozorovanému v terpenových profilech ‘Finola’.

Černé stopy ukazují GC-MS celkový iontový chromatogram (TIC) z testů CsTPS s FPP.

Zelená stopa, tečkovaná čára,

• a) je reprezentativním terpenovým profilem z květenství ‘Finola’. Aby se usnadnilo srovnání s produkty CsTPS7FN, oblast vpravo terpenového profilu ‘Finola’ byla zesílena 30x.
• b) ukazuje stopu CsTPS8FN po injekci za studena (40° C) na DB-wax kolonu.
• c) ukazuje stopu pro CsTPS4FN v koloně HP-5.

Vrcholy:

• n) β-caryophyllen
• o) α-humulen
• p) δ-selinen
• q) selina-6-en-4-ol
• r) valencen
• s) γ-eudesmol
• t) alloaromadendren
• u) palustrol

CsTPS transkripty jsou velmi hojné v pestíkových květech

Byla provedena RT-qPCR na transkriptech pěti CsTPS v glandulárních trichomech izolovaných z pestíkových květů, aby se určilo, do jaké míry přispívají výše popsané geny CsTPS k terpenovému profilu trichomu. Hladiny transkriptů CsTPS1FN, CsTPS2FN, CsTPS3FN, CsTPS6FN, CsTPS9FN byly zkoumány v trichomech izolovaných z osmi vzorků ‘Finola’ mezi druhým a čtvrtým týdnem po začátku fáze květu. Viz Příloha S7 a Obrázek 6.

Těchto pět CsTPS bylo vybráno kvůli tomu, že mají jeden nebo maximálně dva produkty. Proto bylo pokládáno za pravděpodobnější pokusit se korelovat hojnost metabolitu s hojností transkriptu u nich, než by bylo možné u CsTPS s více složkami. Hojnost metabolitů je vyjádřena jako podíl celkových mono- nebo seskviterpenů pro každou jednotlivou rostlinu. Hojnosti transkriptu jsou kalibrované normalizované hodnoty porovnané s dvěma referenčními geny.

Z osmi jednotlivých rostlin vykazovalo sedm z nich pro květenství typické profily terpenových metabolitů. Překvapivě, jeden vzorek neměl žádné detekovatelné monoterpeny z květenství kromě stop (E)-β-ocimenu, ačkoliv trichomy obsahovaly kanabinoidy a seskviterpeny. Viz Příloha S8. Hladiny metabolitů cílových sloučenin jsou vyjádřeny jako podíl celkových mono- nebo seskviterpenů v každém květovém terpenovém extraktu. Viz Obrázek 6A.

CsTPS2FN byl nejhojnějším ze šesti různých změřených TPS transkriptů a jeho hlavní produkt, (+)-α-pinen, byl v průměru také nejhojnějším monoterpenem v 8 zkoumaných rostlinách. Podobně, (E)-β-ocimen a (E)-β-ocimen syntáza CsTPS6FN byly nejméně hojné ze všech měřených metabolitů a transkriptů. Avšak v párech transkript/metabolit byla znatelná jen korelace transkripční úrovně (-)-limonenu a CsTPS1FN. Viz Obrázek 6A. Korelace mezi hladinou metabolitu a transkripční hojností nebyla významná pro žádný jiný pár metabolit/transkript.

Kromě toho byla změřena četnost transkriptu víceproduktové monoterpenové syntázy CsTPS5FN, aby se posoudilo, zda její exprese může přispívat k terpenovému profilu v pryskyřici. Transkripty CsTPS5FN byly, v porovnání s nejvyššími transkripčními úrovněmi jakéhokoliv jiného testovaného CsTPS, vysoce hojné v některých jednotlivých vzorcích. Viz Obrázek 6B. Úrovně transkripce tohoto genu nevysvětlily u výše testovaných párů žádnou z chybějících korelací mezi pěti terpeno-metabolitovými páry.

U rostliny X, která neměla detekovatelné monoterpeny, byly objeveny střední hladiny transkriptu CsTPS5FN. Zdá se, že CsTPS5FN nepřispívá k akumulaci terpenů ve ‘Finola’, ani když je vysoce exprimován.

Diskuse nad výsledky studie

Většina studií zabývajících se konopnými terpeny se zaměřovala na fytochemické složení, zatímco oblastem molekulární biologie a tvorbě terpenů se jich věnovalo velmi málo. Genetické vylepšení konopí (z pohledu požadovaných terpenových profilů) může usnadnit znalost genomiky a genových funkcí biosyntézy terpenů.

Pomocí odrůdy technického konopí ‘Finola’, jejího genomu transkriptomových zdrojů, byly identifikovány geny časných isoprenoidních dráh, stejně jako specifické CsTPS geny a jejich enzymy zapojené do biosyntézy téměř všech různých monoterpenů identifikovaných v extraktech konopných květenství, hustě pokrytých žlázovými trichomy akumulujícími terpeny a kanabinoidy. Výjimkou je terpinolen, u kterého nebyl dosud identifikován CsTPS.

Terpenové profily konopí mohou být vysvětleny aktivitami jedno- i víceproduktových CsTPS. Jednotlivé rostliny ‘Finola’ vykazovaly podstatné rozdíly ve svých mono- nebo seskviterpenových profilech. ‘Finola’ má málo monoterpenových alkoholů nebo éterů (např. linalool, geraniol), které jsou u některých kmenů konopí běžné.

Studie očekávaně nepopisuje další CsTPS, jako je například ten, který kóduje syntázu terpinolenu. Také charakterizace dalších TPS může objasnit špatnou korelaci mezi TPS a hojností jejích produktů zobrazených v Obrázku 6A.

Hledání nového souboru genomu Purple Kush v jiné studii, ke které měli autoři přístup před jejím vydáním, identifikovalo celkem 33 kompletních genových modelů CsTPSKPK a další dílčí sekvence. Viz Obrázek 7. Purple Kush patří mezi odrůdy, které se mohou pěstovat jen se speciální licencí. Charakterizace této komplexnější sady CsTPSPK vyžaduje syntetizované geny a měla by být dokončena v další studii.

Obrázek znázorňuje sadu domnělých ortologních CsTPSFN a CsTPSPK genů, které mohou přispívat k překrývání terpenových profilů v technických a psychoaktivních varietách konopí. U některých ortologních genů se však u různých kmenů mohly vyvinout různé funkce. Neortologní CsTPS mohou přispívat k některým ze stejných terpenových produktů v různých odrůdách konopí.

Například α-pinen je hlavním komponentem kmene označovaného jako Purple Kush. Ale v jeho genomu nebyl nalezen žádný zjevný ortolog α-pinen syntázy CsTPS2 jako v kmenech ‘Finola’ a ‘Skunk’. Dalším příkladem je sada zjevně neortologních jednoproduktových myrcenových syntáz, CsTPS3FN a CsTPS30PK, identifikovaných ve ‘Finola’ a Purple Kush, které sdílejí pouze 52,5% aminokyselinové identity, ale produkují stejné monoterpeny.

Také se očekává, že ne všechny CsTPS přispívají k akumulaci terpenů v pryskyřici z konopných květenství a některé mohou fungovat v jiném kontextu biologie rostlin. Například CsTPS5FN je v květenství exprimován a rekombinantní enzym produkuje směs monoterpenů, ale podstatně nepřispívá k terpenovému profilu pryskyřice.

Ve žlázových trichomech, které se specializují na produkci a akumulaci terpenů, se objevují hojně transkripty několika CsTPS genů (u trichomů izolovaných ve střední fázi květenství) a transkripty spojené s časnou izoprenoidovou biosyntézou a hlavně s dráhou MEP.

Už dříve bylo popsáno, že seskviterpeny se nejhojněji vyskytují v raných fázích květu a proto i transkripty MEV dráhy mohou být hojnější v dřívějších fázích vývoje květu. Odlišné DXS a HMGR geny byly v kořenech exprimovány odlišně než v jiných částech rostliny.

Terpeny v kořenech, pokud jsou v konopí přítomné, mohou přispívat k obraně, jako je tomu u jiných druhů rostlin. Obecně platí, že geny DXS I se zapojují do metabolismu, a geny DXS II do obranných reakcí. Množství transkriptů konopí DXS2, které se shlukují s podrodinou DXS II, naznačuje s obranou související terpenoidy v konopných kořenech a zaručuje budoucí práci na kořenovém metabolomu konopí. Ve studii byla pozorována vysoká četnost transkriptů FPPS ve stamenátových květech a kořenech.

Ze tří předchozích studií vyplývá, že domestikace a selektivní šlechtění může vést ke změnách v terpenových profilech a jejich hojnosti. Například, domestikace může vést ke snížení množství nebo variability terpenů. Domestikace konopí probíhá tisíce let a v důsledku toho nejsou známy profily a ekologické role terpenů v předcích (nedomestikovaných) rostlin konopí.

Tato studie zdůrazňuje velký počet genů CsTPS a rozmanité produkty kódovaných enzymatických aktivit TPS, které přispívají ke komplexnímu terpenovému profilu v konopí. Znalost multigenové povahy CsTPS rodiny a často více produktů kódovaných enzymů bude kritické při selekci, šlechtění nebo vylepšování rostlin přepisováním genomu, zejména terpenových profilů pro standardizované konopné odrůdy.

Přestože v dřívější studiích se občas objevily rostliny konopí bez kanabinoidů, o konopí bez terpenů nejsou v literatuře žádné důkazy. V této studii byl zaznamenán sice jedinec bez monoterpenů, ale stále obsahoval kanabinoidy a seskviterpeny. Toto pozorování naznačuje, že biosyntéza různých tříd terpenoidových metabolitů je regulována nezávisle. Skutečnost, že terpeny přetrvávaly po celou domestikaci jako podstatná a různorodá složka konopné pryskyřice zdůrazňuje jejich význam pro lidské preference.

Informace o studii:

Publikováno: Journal PLOS, 2017

Anglický název: Terpene synthases from Cannabis sativa

PMCID: PMC5371325 / PMID: 28355238

doi: 10.1371/journal.pone.0173911

Autoři: Judith K. Booth, Jonathan E. Page, Jörg Bohlmann

Editor: Björn Hamberger

Pracoviště:

• Michael Smith Laboratories, University of British Columbia, East Mall, Vancouver, B.C., Canada, V6T 1Z4
• Anandia Laboratories, Lower Mall, Vancouver, B.C., Canada, V6T 1Z4
• Botany Department, University of British Columbia, University Blvd, Vancouver, B.C., V6T 1Z4
• Michigan State University, USA