CannaData

Neuroprotektivní účinky fytokanabinoidů z rostliny konopí byly už dříve naznačeny v několika předchozích studiích. Práce italských vědců se soustředí na zhodnocení schopnosti kanabigerolu (CBG) chránit motorické neurony NSC-34 proti toxicitě vyvolané médiem makrofágů RAW 264.7 stimulovaných liposacharidy (LPS).

Pomocí kolorometrického testu pro hodnocení buněčné metabolické aktivity (MTT test) bylo zjištěno, že předběžné ošetření CBG bylo schopno snížit ztrátu životaschopnosti buněk vyvolanou médiem makrofágů stimulovaných LPS v buňkách NSC-34.

Imunocytochemie ukázala, že předběžné ošetření CBG

• snížilo hladiny nitrotyrosinu, proteinů superoxid dismutázy (SOD1) a inducibilní syntázy oxidu dusnatého (iNOS)
• obnovilo hladiny nukleárního faktoru erythroidu (Nrf-2).
• inhibovalo apoptózu (jak ukazuje snížení aktivace kaspázy 3 a exprese Bax), zatímco hladiny Bcl-2 vzrostly
• působilo protizánětlivě, což se projevilo snížením hladiny proteinů interleukinu-1β (IL-1β), faktoru nádorové nekrózy (TNF-α), interferonu-γ (IFN-γ) a PPARy
• také působilo proti oxidačnímu stresu v NSC-34 buňkách

Výsledky této in vitro studie jsou v souladu s předchozími studiemi, které prokázaly protizánětlivou aktivitu CBG (i jeho derivátů) a jiné prospěšné účinky.

Oxidační stres a záněty významně ovlivňují vznik a vývoj neurodegenerativních poruch jako je např. roztroušená skleróza nebo Alzheimerova a Parkinsonova choroba. Látky s protizánětlivými a antioxidačními účinky mohou být potenciálním řešením proti neurodegeneraci, poškození neuronálních buněk a/nebo progresi souvisejících onemocnění. Výzkum se v posledních letech úspěšně věnuje protizánětlivým účinkům kanabidiolu CBD, ale i kanabigerol CBG má velké předpoklady.

Konkrétní vliv CBG na in vitro model neuroinflamace

Výsledky naznačují významné neuroprotektivní účinky kanabigerolu, který by se tak mohl stát potenciální léčbou proti neuroinflamaci a oxidačnímu stresu. Každý experiment byl proveden třikrát.

Jaký typ kanabigerolu byl při studii použit?

Jeden kilogram na prášek rozdrcených květů byl zahříván 2,5 hodiny při teplotě 120° C. Tak se dekarboxylovaly prekanabinoidy, které byly následně extrahovány pomocí shakeru a acetonu. Po odstranění rozpouštědla zbyde černý pryskyřicový zbytek (74 g tzn. 7.4%). Ten se rozpouští v MeOH v poměru 30 ml/gram extraktu. Pro odstranění vosků a pigmentu je třeba filtrace.

Po odpaření metanolu vznikne 36 gramů tmavě zeleného extraktu, který je vyčištěn gravitační sloupcovou chromatografií. Výsledkem je 5 gramů žlutého oleje, který následně krystalizuje do podoby 3 gramů čistého CBG (0,3%).

CBG zvýšil životaschopnost buněk u motorických neuronů NSC-34

Expozice médiu makrofágů stimulovaných LPS snížila životaschopnost buněk, ale předběžné podání CBG je částečně obnovilo. Motorické neurony NSC-34 byly inkubovány po dobu 24 hodin dávkami CBG v těchto mikromolárních koncentracích: 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 a 20 µM (μmol/dm3). U všech dávek, bez ohledu na koncentraci, bylo ve srovnání s kontrolním vzorkem viditelné zvýšení životaschopnosti buněk, ačkoliv rozdíl nebyl statisticky významný. Především u dávek v rozmezí 2,5 až 7,5 µM bylo zaznamenáno 20% zvýšení.

U vyšších koncentrací se proliferace buněk sice snížila, ale stále byla vyšší než u kontrolního vzorku. V další analýze byly zkoumány také NSC-34 buňky inkubované dimethylsulfoxidem (DMSO) s podobnými koncentracemi. Žádná cytotoxicita nebyla pozorována. Další pokusy probíhaly s koncentrací 7,5 µM CBG, protože u ní byl nejvyšší nárůst buněčné životaschopnosti. Viz Obrázek 1.

CBG působil proti ztrátě životaschopnosti buněk a inhiboval apoptózu v buňkách NSC-34 ošetřených médiem makrofágů stimulovaných LPS

Inkubace s médiem makrofágů RAW 264.7 stimulovaných LPS způsobila v porovnání s kontrolním vzorkem významnou ztrátu, asi o 50%, životaschopnosti buněk. Jak je vidět v Obrázku 1B, předběžné ošetření CBG v koncentraci 7,5 µM bylo schopné ztrátu životaschopnosti buněk snížit.

Indukce apoptózy v motorických neuronech NCS-34 vystavených médiu makrofágů ošetřených LPS byla prokázána významným zvýšením hladin proteinu štěpené kaspázy 3 a Bax. Exprese Bcl-2 byla snížena.

Naopak předběžné ošetření CBG apoptózu inhibovalo a také vyrušilo zvýšení Bax hladiny i snížilo štěpenou kaspázu 3. Exprese Bcl-2 vzrostla. Kontrolní vzorky a buňky NSC-34 ošetřené samotným CBG exprimovaly Bcl-2, ale už ne Bax ani štěpenou kaspázu 3. Viz výsledky imunocytochemického testu na Obrázku 2.

CBG snížil expresi prozánětlivých cytokinů a proliferátorem aktivovaného receptoru γ (PPARγ)

Ošetření motorických neuronů NSC-34 médiem makrofágů stimulovaných LPS vyvolalo zánět demonstrovaný zvýšenými proteinovými hladinami prozánětlivých cytokinů IL-1β, TNF-α a IFN-γ. Obrázek 3 ukazuje výsledky imunocytochemického testu. Předběžné ošetření CBG bylo schopno snížit hladiny všech tří uvedených proteinů. Motorické neurony NSC-34 u kontrolního a CBG ošetřeného vzorku neexprimovaly prozánětlivé cytokiny.

Kromě toho v motorických neuronech NSC-34 ošetřených médiem RAW 264.7 byla pozorována exprese PPARγ. Předběžné ošetření CBG ale hladiny jeho proteinů snížilo. Viz Obrázek 4.

CBG projevil antioxidační účinek v buňkách NSC-34 ošetřených médiem makrofágů stimulovaných LPS

Antioxidační účinek CBG je důležitý kvůli tomu, že mozek je obzvláště citlivý na změny v buněčném redoxním stavu. Udržení redoxní homeostázy v mozku je tedy kritickým bodem pro prevenci poškození oxidačním stresem.

Ošetření motorických neuronů NSC-34 médiem makrofágů RAW 264.7 vyvolává oxidační stres, což se projevuje zvýšením hladiny nitrotyrosinu a je to patrné na výsledcích imunocytochemického testu. Jak je vidět v Obrázku 5, předběžné ošetření CBG však bylo schopno jeho expresi snížit.

Kanabigerol byl navíc schopen působit proti zvýšení exprese SOD1 a iNOS indukované působením média RAW 264.7. Motorické neurony kontrolních vzorků a vzorků ošetřených samotným CBG prokázaly nepřítomnost exprese oxidačního markeru.

Kontrolní vzorek a motorické neurony NSC-34 vystavené CBG exprimovaly Nrf-2. Po expozici médiem makrofágů stimulovaných LPS se hladiny Nrf-2 snížily. Jak je vidět v Obrázku 6, předběžné ošetření CBG však hladiny Nrf-2 obnovilo. Kontrolní buňky a buňky ošetřené samotným CBG exprimovaly Nrf-2.

Závěry studie

Výsledky studie naznačily, že fytokanabinoid CBG uplatnil protektivní charakter v in vitro modelu neuroinflamace. Kanabigerol snížil neuronální smrt v buňkách NSC-34 ošetřených médiem LPS stimulovaných makrofágů a tak snížil zánět a oxidační stres. CBG dále obnovil buněčnou antioxidační obranu a zvýšil expresi Nrf-2.

Kvůli neuroprotektivním účinkům dokázaných těmito výsledky podporují italští vědci další použití CBG proti neurodegeneraci nebo u patologických stavů ovlivněných neuroinflamací a oxidačním stresem.

Informace o studii:

Publikováno: International Journal of Molecular Sciences, 2018

PMID: 29986533, PMCID: PMC6073490

https://doi.org/10.3390/ijms19071992

Anglický název: In Vitro Model of Neuroinflammation: Efficacy of Cannabigerol, a Non-Psychoactive Cannabinoid

Autoři:

Agnese Gugliandolo, Federica Pollastro, Gianpaolo Grassi, Placido Bramanti, Emanuela Mazzon

Pracoviště:

• IRCCS Centro Neurolesi “Bonino Pulejo”, 98124 Messina, Italy;
• Department of Pharmaceutical Sciences, University of Eastern Piedmont “Amedeo Avogadro”, 28100 Novara, Italy;
• Research Centre for Industrial Crops, Council for Agricultural Research and Economics (CREA-CIN), 45100 Rovigo, Italy;

Originální PDF volně ke stažení